РЕЦЕПТЫ ОСНОВНЫХ ПИТАТЕЛЬНЫХ СРЕД

РЕЦЕПТЫ ОСНОВНЫХ ПИТАТЕЛЬНЫХ СРЕД

Мясная вода Парную говядину или конину освобождают от костей, жира, сухожилий, пропускают через мясорубку. 1 кг полученного мясного фарша заливают 2 л водопроводной воды и кипятят в течении часа, накипь снимают. После кипячения мясную воду остужают для застывания жира, который легко при этом удаляется, фильтруют через ватно-марлевый фильтр до полной прозрачности, затем доливают водопроводной водой до первоначального объема, разливают в бутыли и стерилизуют 20 минут при температуре +120 0 С.

Пептонная вода К 1л дистиллированной воды прибавляют 1- 2г пептона и 0,5г хлорида натрия, устанавливают необходимое значение рН, кипятят 30 минут, проверяют рН, фильтруют через бумажный фильтр до полной прозрачности и стерилизуют при температуре +120 0 С в течение 30 минут.

Мясо-пептонный бульон К 1 л мясной воды добавляют 1г сухого пептона и 5мг хлорида натрия, устанавливают нейтральную рН, кипятят в течении 30 минут, после чего доводят уровень воды до первоначального объема. Затем фильтруют через бумажный фильтр, окончательно устанавливают насыщенным расвором гидрокарбоната натрия или 10% раствором едкого натра требуемую реакцию, стерилизуют 15-20 минут при температуре +120 0 С. Если после стерилизации в мясо-пептонном бульоне выпадает осадок, его фильтруют вторично и снова стерилизуют. Вторичная стерилизация производится при более низкой температуре, чем предшествующая, для предотвращения выпадения осадка.

Мясо-пептонный агар К 1л мясной воды прибавляют 1г пептона и 0,5г хлорида натрия, кипятят на слабом огне при постоянном помешивании до полного растворения добавленных ингредиентов. Приготовленный таким образом бульон фильтруют, устанавливают слабощелочную реакцию (рН 7,2-7,4) и добавляют 0,2-2г измельченного агар-агара (в зависимости от качества агар-агара и назначения среды). После добавления агар-агара жидкость кипятят на слабом огне при постоянном помешивании до полного растворения агара. При помутнении среды ее просветляют. Приготовленный агар фильтруют или декантируют, разливают в пробирки или во флаконы и стерилизуют в автоклаве при температуре +120 0 С в течение 20 минут.

Сахарный бульон (бульон с глюкозой) К 1л мясопептонного бульона нейтральной реакции прибавляют глюкозу в количестве 0,25мг-2г. Перед добавлением к бульону глюкозу растворяют в небольшом количестве дистиллированной воды. Приготовленную среду стерилизуют текучим паром 3 дня подряд по 30 минут или однократно в автоклаве при температуре +115 0 С 30 минут.

Триптический перевар Хоттингера Говяжье мясо освобождают от костей, жира, сухожилий, нарезают мелкими кусочками, взвешивают и опускают в кипящую воду из расчета 1 кг мяса на 1 л воды. Мясо кипятят в течение 15-20 минут, затем вынимают и пропускают через мясорубку. Бульон смешивают с фаршем и сливают в бутыль с таким расчетом, чтобы 1/3 бутыли оставалась свободной. К горлышку бутыли подбирают хорошо пригнанную резиновую пробирку. Смесь подщелачивают 20% раствором питьевой соды до рН 7,8-8,0, прибавляют очищенную от жира, соединительной ткани и дважды пропущенную через мясорубку поджелудочную железу в количестве 10% к имеющемуся объему (на 1 л жидкости 100 г железы). Вместо панкреатической железы можно прибавить панкреатин в количестве 0,5% и выше в зависимости от его активности. Через 1-2 часа после добавления фермента проверяют реакцию перевара и подщелачивают его повторно до рН 7,4-7,5. Отсутствие сдвига реакции смеси в сторону окисления после прибавления фермента указывает на его недоброкачественность. Содержание бутыли тщательно перемешивают, добавляют хлороформ из расчета 10-30 мл на каждый литр перевара. Бутыль плотно закрывают резиновой пробкой и ставят в термостат при +37 0 С на 7-10 суток. В течении первого дня содержимое бутыли перемешивают вначале каждые 15-20 минут, затем через 2-3 часа, а в последующие дни – по нескольку раз в день, открывая при этом пробку для выхода избытков паров хлороформа. При стоянии в термостате мясо ферментируется, преврящаясь в однородный осадок серовато-желтого цвета, а жидкость из мутно-серой становится совершенно прозрачной, соломенно-желтого цвета. Об окончании переваривания судят по образованию триптофана, обнаруживаемого следующим образом: в пробирку наливают 3-4 мл фильтрованного перевара, добавляют 3-4 капли бромной воды. При наличии триптофана жидкость принимает розово-фиолетовый цвет. Приготовление бромной воды. На 100 мл дистиллированной воды берут 3-3,5 мл чистого брома для получения насыщенного раствора. Хранят в склянке темного стекла.

Кровяной агар Расплавляют 1л 2% мясо-пептонного стерильного агара, охлаждают его до температуры +45 0 С и прибавляют 5-10мл дефибринированной стерильно взятой крови лошади, кролика или барана. Добавление крови производят, соблюдая правила стерильности. Готовую среду разливают в стерильные чашки Петри (предварительно нагретые в термостате), дают ей застыть и подсушивают в термостате. Слой агара должен быть равномерно окрашен в красный цвет.

Бульон на переваре Хоттингера Для приготовления бульона основной перевар Хоттингера разводят в несколько раз дистиллированной или водопроводной водой, добавляя на 1л бульона 0,5мг хлорида натрия, 1мг двузамещенного фосфата калия, устанавливают рН 7,4-7,6 и кипятят 15-20 минут. Приготовленный таким образом бульон фильтруют через ватно-марлевый или бумажный фильтр, разливают во флаконы или пробирки и стерилизуют при температуре +120 0 С в течение 20-30 мин.

Желточно-солевой агар (Чистовича) Для приготовления желточно-солевого агара готовят впрок мясо-пептонный агар (рН 7,2-7,4) с содержанием 10% хлорида натрия. После разливки во флаконы по 100-200 мл агар стерилизуют в автоклаве в течение 20 минут при температуре +120 0 С. Перед употреблением расплавливают, охлаждают до +45-50 0 С и добавляют 20% по объему) стерильной желточной взвеси (1 желток куриного яйца на 150-200 мл стерильного изотонического раствора хлорида натрия). Среду быстро помешивают, разливают в стерильные чашки, которые продолжительное время могут сохраняться в холодильнике.

Молочно-солевой агар К 1л расплавленного мясо-пептонного агара рН 7,2-7,4, содержащего 5-7,5г хлорида натрия, добавляют 10мл стерильного теплого хорошо обезжиренного молока, тщательно перемешивают и разливают в чашки.

Среда Эндо Мясо-пептонный (100 мл) агар рН 7,4 растапливают и охлаждают до температуры +70 0 С, прибавляют 1 г лактозы, предварительно растворенной в стерильной пробирке в небольшом количестве дистиллированной воды и прокипяченной. В отдельных пробирках приготовляют: 2-3 мл спиртового насыщенного основного фуксина; В стерильную пробирку отмеривают 1 мл фуксина и прибавляют раствор сульфида натрия до обесцвечивания фуксина (бледно-розовый цвет). Приготовленную смесь вливают в растопленный агар, хорошо перемешивают и разливают по чашкам. Горячий агар имеет бледно-розовый цвет, а при застывании становится бесцветным. Среду готовят в день ее использования.

Среда Ресселя К 100 мл мясо-пептонного агара (рН 7,2) прибавляют 1г лактозы, 1г глюкозы и 1 мл индикатора Андреде. Среду разливают в пробирки в количестве 5-6 мл, стерилизуют в автоклаве при +112 0 С в течение 20 минут и скашивают так, чтобы на 2-3 см от дна пробирки агар оставался в виде столбика. Ферментацию лактозы определяют по появлению малиновой окраски соответственно добавленному индикатору Андреде в скошенной части среды, сбраживание глюкозы – по окраске столбика. При сбраживании лактозы и глюкозы происходит резкое покраснение всей среды: столбика и скошенной его части. Характер изменения цвета среды Ресселя определяется не одинаковой интенсивностью расщепления микроорганизмами азотистых веществ и образованием щелочных продуктов в аэробных и анаэробных условиях. Газообразование в среде определяют по вспениванию конденсационной жидкости на дне пробирки, а также по образованию трещин и разрывов в агаре.

Цитратный агар Симмонса Растворяют в 1 л дистиллированной воды сульфата магния 2мг, фосфата натрия-аммония 1,5 г, одноосновного фосфата калия 1 г, цитрата натрия кристаллического 3 г, Смесь стерилизуют в автоклаве. Прибавляют 20 г агар-агара, нагревают до его расплавления, устанавливают рН 7,2 и затем прибавляют 1 мл 1,5% спиртового раствора бромтимолового синего.

Среда Сабуро Помещают 18 г агара в 1 л дистиллированной воды и дают ему набухать 30 мин, нагревают, помешивая, пока не растворится агар, добавляют 10 г пептона и 40 г глюкозы или мальтозы. Стерилизация среды проводится в течение 15 мин при +115 0 С.

Среда Китта-Тароцци Печень животного, обычно говяжью, нарезают кусочками по 1,0-1,5 г, прибавляют по весу тройное количество мясо-пептонного бульона или бульона Хоттингера нейтральной реакции, кипятят 30 минут. Бульон отфильтровывают, печень промывают под краном на сите. Отфильтрованный бульон разливают по 7-10 мл в пробирки. В каждую пробирку кладут по 4-5 кусочков отмытой печени. Бульон сверху заливают слоем вазелинового масла и стерилизуют в автоклаве при давлении 0,5 атм 30 минут.

Кровяной агар Цейсслера К 1л 3% мясо-пептонного агара прибавляют 1г глюкозы, устанавливают рН 7,2, разливают во флаконы по 100 мл, стерилизуют при давлении 0,5 атм 30 минут. Перед употреблением к расплавленной и охлажденной до +45 0 С среде прибавляют 20мл свежей дефибринированной крови. Среду разливают в чашки Петри.

Кровяной сахарный агар Агар 2% на бульоне Хоттингера в объеме 100 мл расплавляют и охлаждают до +45 0 С, после чего добавляют к нему 10-15 мл свежевзятой стерильной дефибринированной крови кролика, барана или крупного рогатого скота и 10 мл 20% стерильного раствора глюкозы. Смесь взбалтывают так, чтобы не образовалось пузырей пены, и разливают по чашкам.

Рецепт агар питательная среда

Рецепт 61. Мясопептонный агар. МПА применяют для выращивания неприхотливых микроорганизмов и как основу специальных сред для культивирования более требовательных микробов (сывороточного, кровяного, асцитического агара и др.)

Пептон — 10,0-20,0 г
Натрия хлорид — 5,0 г
Агар — 10,0-20,0 г
Вода мясная — 1000 мл

Смесь пептона, хлорида натрия и мясной воды кипятят на слабом огне при постоянном помешивании до полного растворения ингредиентов. Бульон фильтруют, устанавливают pH и добавляют измельченный агар (в зависимости от качества агара и назначения среды). Затем среду кипятят на слабом огне при постоянном помешивании до полного растворения агара. При помутнении среды ее просветляют одним из известных способов. Приготовленную среду разливают в пробирки или во флаконы, стерилизуют в автоклаве при 121 °С в течение 20 мин.

Рецепт 62. Питательный бульон (HiMedia, Nutrient Broth, Cat. M002):

Пептон — 5,0 г
Натрия хлорид (NaCl) — 5,0 г
Экстракт говяжий — 1,5 г
Экстракт дрожжевой — 1,5 г
pH 7,4(±0,2)

Суспендируют 13 г сухой смеси в 1000 мл дистиллированной воды. Кипятят до полного растворения внесенных ингредиентов. Стерилизуют при 121 °С в течение 15 мин.

Среду используют для выращивания неприхотливых микробов. Добавление крови, сыворотки и других ингредиентов делает ее пригодной для роста требовательных микроорганизмов.

Рецепт 63. Питательный бульон (HiMedia, Nutrient agar, Cat. M001). Питательный агар рекомендуют использовать для выращивания широкого спектра микроорганизмов, не требующих специальных питательных добавок.

Пептон — 5,0 г
Натрия хлорид — 5,0 г
Экстракт говяжий — 1,5 г
Экстракт дрожжевой — 1,5 г
Агар — 15,0 г
pH 7,4 (±0,2)

Суспендируют 28 г сухой смеси в 1000 мл дистиллированной воды. Кипятят при постоянном помешивании до полного растворения внесенных ингредиентов. Стерилизуют при 121 °С в течение 15 мин.

Редактор: Искандер Милевски. Дата публикации: 13.09.2019

Приготовление агаризованной питательной среды МС

Ход выполнения работы:

1. В химический стакан емкостью 2 л поместить 20 г сахарозы, долить дистиллированнй водой до 400 мл и растворить.

2. Добавить к раствору сахарозы 50 мл маточного раствора макросолей, 1 мл микросолей, 5 мл хелата железа, 5 мл хлористого кальция.

3. Приготовить агар: навеску 5 -7 г поместить в стакан и залить водой до 200 мл, растворить, нагревая на плитке или газовой горелке, при постоянном помешивании. Готовый агар долить к раствору солей.

4. Питательную среду довести до нужного объема (1л) дистиллированной водой. Измерить рН среды: если рН превышает 5,5 – 6,0 добавить несколько капель 0,1 н НСl, если ниже этого значения – 0,1 н КОН.

5. Готовую питательную среду разлить в пробирки на 1/3 объема, закрыть пробки ватными пробками, помесить пробирки в металлические штативы.

6. Штативы с пробирками завернуть в целлофановую бумагу (чтобы в автоклаве не открылись пробки).

7. Поместить штативы с пробирками в автоклав и проавтоклавировать.

1. Питательные среды, их особенности, состав и применение.

2. От чего зависит выбор питательной среды?

3. Методика приготовления питательных сред для культивирования клеткок растений.

4. Какие вещества входят в состав питательных сред, и какую функцию они выполняют в культуре клеток и тканей in vitro?

5. Устройства для приготовления питательных сред.

6. Какой фактор влияет на нормальный рост и развитие растений в условиях in vitro и почему ?

Лабораторная работа № 5

Подготовка растительного материала и изоляция эксплантов

Цель работы:изучить теоретические основы способов выращивания куллусных культур и освоить практические навыки работы по их выращиванию, в частности, ознакомиться с первыми этапами выращивания – подготовкой растительного и изоляцией эксплантов.

Теоретические основы

Получить стерильный материал из семян огурца и пшеницы селекционных образцов часто бывает достаточно трудно, что связано с необходимостью выбора стерилизующего агента. Наиболее распространены в культуре in vitro стерилизаторы, содержащие активный хлор: гипохлориты кальция и натрия в концентрации 35 г/л; стерилизующие растворы, содержащие ртуть (сулема и диацид), в концентрации 0,1 %; пероксид водорода в концентрации 10-12 %; антибиотики в концентрации 4-5 мг/л. Как правило, стерилизующее вещество должно обеспечивать наибольший процент неповрежденных тканей под семенной оболочкой, способных к росту и новообразованиям при наименьшем проценте инфекции. Продолжительность стерилизации эксплантов следует также тщательно подбирать.

Получение стерильных эксплантов состоит из трех этапов: предстерилизацией, стерилизацией и постстерилизацией.

Перед стерилизацией семена промывают на сите теплой проточной водой, затем помещают в марлевые мешочки, в которые кладут этикетки с указанием номера генотипа. После этого марлевые мешочки вносят в стерильный бокс, где последовательно проводят все операции по стерилизации. Стерильные проростки, полученные из семян, используют в дальнейшей работе для получения:

· эксплантов верхушечных меристем;

· первичного каллуса из тканей листьев, сегментов щитка и изолированных зародышей (пшеница).

Стерильные проростки выращивают с целью изолирования эксплантов для получения каллусной ткани или прямой регенерации растений. В зависимости от задачи опыта семена проращивают на воде или на агаризованной питательной среде.

Приборы и материалы:семена различных растений (20 шт.), стерильные чашки Петри с одним-двумя слоями фильтровальной бумаги, химические стаканы (3 шт.), пробирки, пинцеты, ножницы, марлевые мешочки, колбы на 250 мл со стерильной дистиллированной водой, 0,1 %-ный раствор сулемы, 96 %-ный спирт, спиртовка.

Ход выполнения работы:

Отбирают 10 здоровых, одинаковых по размеру семян, тщательно промывают в мыльном растворе, затем под проточной водой. Помещают в марлевые и в ламинар-боксе погружают на 10 с в 96 % спирт, затем в 0,1 % раствор сулемы или диацида на 10-15 минут. После этого семена промывают в 3-5 объемах стерильной дистиллированной воды и слегка подсушивают. Пинцетом раскладывают по 10 семян в чашки Петри на один-два слоя фильтровальной бумаги и добавляют по 10-15 мл стерильной воды, закрывают крышками. Подготовленные в чашках Петри объекты проращивают в термостате при 25 о С или в световой комнате в течение 2-3 суток. В рабочей тетради зарисовывают схему процесса стерилизации и заполняют таблицу, выполненную по форме 1, с указанием стерилизующего агента и экспозиции для стерилизации семян.

Характеристика методов стерилизации семян

Метод стерилизации	Стерилизующее вещество	Концентрация, % (мл)	Экспозиция, Мин и с	Цель стерилизации
Предстерилизация
Стерилизация
Постстерилизация

Приборы и материалы:семена подсолнечника, гороха, фасоли и др., стерильные чашки Петри, коническая колба на 300… 500 мл, дно которой покрыто ватой, смоченной водой, или фильтровальной бумагой, вода, химические стаканы (2 шт.), пробирки с питательной средой МС (1/2 нормы) без гормонов.

Ход выполнения работы

Отбирают 10 здоровых, одинаковых по размеру семын, тщательно промывают в мыльном растворе, затем водопроводной и дистиллированной водой. Помещают в марлевые мешочки и погружают на 1-2 минуты в 96 %-ный спирт, после чего стерилизуют 0,1 % -ным раствором сулемы или 3 % раствором хлорамина в течение 15 минут. Далее промывают в стерильной дистиллированной воде, сменяя ее 5-6 раз.

В ламинар-бокс с помощью стерильного пинцета раскладывают 10 семян в стерильную колбу на влажную вату или фильтровальную бумагу; мелкие семена (табака, моркови и т.д. ) можно проращивать в чашках Петри на фильтровальной бумаге, обильно смоченной стерильной водой. Для получения стерильных проростков на агаризованной питательной среде МС в одну пробирку помещают по одному семени. Пробирки, колбы и чашки Петри с семенами ставят в термостат или в световую комнату на 5 дней, где поддерживают температуру 25 о С.

1. Какие стерилизующие агенты вы знаете?

2. Методика получения стерильных эксплантов.

3. От чего зависит время экспозиции эксплантов?

Лабораторная работа № 6

Посадка и культивирование эксплантов на агаризованной среде

Цель работы:Изучить теоретические основы способов выращивания куллусных культур и освоить практические навыки работы по их выращиванию.

Теоретические основы

Культура изолированных тканей обычно представлена каллусными и гораздо реже опухолевыми тканями. Каллусная ткань образуется в результате повреждения на целых растениях, а также в стерильной культуре на эксплантах – фрагментах ткани или органа, используемых для получения первичного каллуса.

Каллусная ткань in vitro в основном бывает белого или желтоватого, реже светло-зеленого цвета. Очень редко она может иметь интенсивную зеленую окраску. Темно-коричневая окраска чаще всего появляется при старении каллусных клеток и связана с накоплением фенолов. Последние окисляются в хиноны. Для избавления от этих соединений в питательные среды вносят антиоксиданты. Каллусная ткань аморфна и не имеет конкретной анатомической структуры, но в зависимости от происхождения и условий выращивания она может быть разной консистенции:

· рыхлой, состоящей из сильно обводненных клеток, легко распадающейся на отдельные мелкие клетки;

· средней плотности, с хорошо выраженными меристематическими очагами;

· плотной, в которой дифференцируются элементы камбия и проводящей системы.

Обязательным условием дедифференцировки растительной клетки и превращения ее вкаллусную является присутствие в питательной среде представителей двух групп фитогормонов: ауксинов и цитокининов. Ауксины вызывают процесс дедифференцировки клетки, подготавливающий ее к делению, а цитокинины – пролиферацию( деление) дедифференцированных клеток.

Каллусная клетка в результате деления, которого возникла каллусная ткань или каллус, представляет собой один из типов клеточной дифференцировки, присущей всему растению. Для растения каллус является тканью, которая защищает место поранения, накапливает питательные вещества для анатомических структур или утраченного органа. Дифференцированные клетки объединяются в растении, в ткани и выполняют определенные функции. Клетки различаются не только функционально, но и морфологически.

На питательных средах с большим содержание ауксинов (2,4Д) клетки экспланта дедифференцируются и переходят к пролиферации. Особенности дедифференцировки клеток экспланта зависят от генетики и эпигенетики экспланта. Клетки утрачивают прежние функции и морфологию. Причем, чем меньше структурно и химически дифференцирована клетка, тем легче получить каллус. В клетке, готовящейся к делению, стимулируется синтез всех форм РНК, начинается репликация ДНК, исчезают специфические тканевые белки – антигены, синтезируются новые, специфичные для каллусных клеток. Меняется активность структурных генов и белкового аппарата клеток. Дедифференциация специализированных клеток начинается с обогащения их элементами цитоплазмы: микротрубочками, мембранами ЭПС и комплекса Гольджи, рибосомами, исчезают хлоро– и хромопласты, продукты их деятельности; может образоваться много ядер или увеличиться число хромосом; укрепляются вакуоли.

Каллус, выращиваемый поверхностным способом, представляет собой аморфную массу тонкостенных паренхимных клеток, не имеющую строго определенную структуру. Клетки каллуса либо бесцветны, либо имеют желтоватый оттенок. В зависимости от происхождения и условий культивирования различают каллусы: рыхлые, с сильно оводненными, легко отделяющимися друг от друга клетками; средней плотности, с зонами меристематической активности; плотные, с зонами редуцированного камбия и сосудов.

В биотехнологии, для отработки методик культивирования, чаще всего используют те виды растений, которые и в обычных условиях легко укореняются, регенерируют, образуют каллус. Поэтомубольшинство методов получения и культивирования каллуса разработано для табака. Каллусы можно получить практически из любой части растения, так как клетки табака легко дедифференцируются и переходят к пролиферации. Для культивирования каллусов из листьев табака используют среду Мурасиге-Скуга с добавлением ауксинов (2,4 Д).

Каллусы из различных органов пшеницы на искусственных питательных средах впервые были получены в 1968 году. Их можно использовать для изучения солеустойчивости, устойчивости к температурному стрессу, получения суспензий и протопластов.

Для индукции каллусогенеза обычно используют стерильные пробирочные растения, выращенные из зародышей на средах без гормонов.

Растения для получения каллусов можно вырастить в теплице. Для этого набухшие семена помещают на 5 недель в холодную камеру на яровизацию при 2 о С, проростки высаживают в вегетационные сосуды и выращивают до достижения молочною спелости. Незрелые зародыши выделяют и переносят на питательные среды.

Каллусы можно получать из разных частей растения, в том числе из кончиков корней. Образование каллуса происходит в области первичных и вторичных меристем. Процесс калусообразования зависит от размера экспланта. Оптимальная величина экспланта 5-10 мм 3 и масса 20-100 мг.

Многие ткани имеют физиологическую полярность. Поэтому каллус лучше образуется на той стороне экспланта, которая ближе к апикальным меристемам корня. Кончики корней легко образуют каллус, если они помещены на среду горизонтально, тогда как сегменты стебля лучше формируют каллус, если их поместить вертикально.

Для культивирования на питательных средах лучше использовать стерильные корешки, полученные при проращивании семян в стерильных условиях.

Для культивирования стерильных проростков необходимо использовать ламинар – боксы, обеспечивающие посадку эксплантов на питательную среду без заражения микроорганизмов.

Все поверхности ламинара обрабатываются 96% спиртом, простерилизованные инструменты, материалы, растительный материал помещают на стол ламинара и включают УФ – излучение. Через 20 минут выключают УФ и включают биофильтры. Для работы в ламинар – боксе надевают стерильный халат и шапочку, руки обрабатывают 96% спиртом. Пинцеты, скальпели и препаровальные иглы помещают в стакан с 96% спиртом. Перед каждой манипуляцией инструменты обжигают на пламени спиртовки.